TUGAS METODE PEMERIKSAAN PENEGAKAN DIAGNOSIS ANEMIA

METODE PEMERIKSAAN PENEGAKAN DIAGNOSIS ANEMIA

                             DISUSUN OLEH
NAMA : VIRA SAPUTRI
NIM : 18 3145 353 103
KELAS : 2018 C



PROGRAM STUDY DIV TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS
   FAKULTAS FARMASI, TEKNOLOGI RUMAH SAKIT DAN INFORMATIKA
UNIVERSITAS MEGA REZKY
MAKASSAR
2020
1. TES DARAH RUTIN
A. Pra Analitik
1) Persiapan pasien : Tidak ada persiapan pasien
2) Persiapan sampel : Darah EDTA 10%
3) Prinsip : Impedance berupa larutan elektrolit (dilluent) yang telah dicampur dengan sel-sel darah melalui aperture, hambatan antara kedua elektroda tersebut akan naik sesaat dan terjadi perubahan tegangan yang sangat kecil sesuai dengan nilai tahanannya.
4) Alat dan bahan
• Hematologi analyer
• Tabung reaksi
• Rak tabung
5) Metode : Volumetric impedance
B. Analitik
1) Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2) Dihidupkan UPS, ditekan main power yang terletak pada bagian belakang alat, sehingga lampu indikator main power menyala.
3) Ditekan tombol power yang terdapat pada bagian depan alat, alat akan secara otomatis melakukan cleaning dan priming.
4) Ditunggu sampai alat siap digunakan.
5) Dilakukan pembacaan kontrol.
6) Dimasukkan data pasien pada computer/display lalu dikirim data tersebut ke alat.
7) Dipastikan darah tidak menggumpal pada tabung dan dimasukkan sampel pada rak tabung sesuai data pasien yang telah diinput, kemudian tekan tombol start dan akan dilakukan analisa oleh alat.
8) Hasil akan dikeluarkan dalam bentuk print out.
C. Pasca Analitik
1) Eritrosit
Wanita : 4 juta-5 juta/ul darah
Pria : 4,5 juta-5,5 juta/ul darah
2) Hemoglobin
Wanita : 12-14 g/dl
Pria : 14-16 g/dl
3) Hematokrit
Wanita : 38-46%
Pria : 40-54%
4) Leukosit : 5 juta-1 juta/ul darah
5) Trombosit : 150.000-400.0004/ul darah
6) Laju endap darah
Wanita : <15
P4ria : <10
7) Indeks eritrosit
MCH : 7-31 pg
MCV : 80-96 fl
MCHC : 32-36 g/dl
2. TES APUSAN DARAH TEPI
A. Pra Analitik
1) Persiapan pasien: tidak memerlukan persiapan khusus.
2) Prinsip tes:
• Prinsip sediaan apus: dibuat apusan darah pada kaca objek. 
• Prinsip pewarnaan didasarkan pada sifat kimiawi dalam sel. Zat warna yang bersifat asam akan bereaksi dengan komponen sel yang bersifat alkalis, demikian pula sebaliknya. Pewarnaan sediaan apus menggunakan prinsip Romanosky yaitu menggunakan dua zat warna yang berbeda yang terdiri dari Azure B (trimethylthionin) yang bersifat basa dan eosin Y (tetrabromoflourescein) yang bersifat asam seperti yang dianjurkan oleh The International Council for Standardization in Hematology, dan pewarnaan yang dianjurkan adalah Wright-Giemsa dan May Grunwald-Giemsa (MGG).
3) Persiapan sampel:
• Darah kapiler segar akan memberikan morfologi dan hasil pewarnaan yang optimal pada sediaan apus.
• Darah EDTA (etilen diamin tetra asetat). EDTA dapat dipakai karena tidak berpengaruh terhadap morfologi eritrosit dan lekosit serta mencegah trombosit bergumpal. Tes sebaiknya dilakukan dalam waktu kurang dari 2 jam. Tiap 1 ml EDTA digunakan untuk 1 ml darah vena.
4) Alat dan bahan
• Alat
a. Kaca Objek 25x75 mm
b. Batang  gelas 
c. Rak kaca objek
d. Pipet Pasteur
• Bahan/reagen
a. Metanol absolut dengan kadar air kurang dari 4%, disimpan dalam botol yang tertutup rapat untuk mencegah masuknya uap air dari udara
b. Zat warna Wright 
c. Methanol absolut
d. Larutan dapar pH  6,4
e. Zat warna
f. Zat warna May - Grunwald  Methylene blue dalam methanol 1% eosin dan 1 % methylene blue
B. Analitik
1) Cara Membuat Sediaan Apus
a. Dipilih kaca objek yang bertepi rata untuk digunakan sebagai „kaca penghapus sudut kaca objek yang dipatahkan, menurut garis diagonal untuk dapat menghasilkan sedian apus darah yang tidak mencapai tepi kaca objek.
b. Satu tetes kecil darah diletakkan pada ± 2 –3 mm dari ujung kaca objek. Kaca penghapus diletakkan dengan sudut 30 – 45 derajat terhadap kaca objek didepan tetes darah.
c. Kaca pengapus ditarik ke belakang sehingga tetes darah, ditunggu sampai darah menyebar pada sudut tersebut.
d. Dengan gerak yang mantap, kaca penghapus didorong sehingga terbentuk apusan darah sepanjang 3 – 4 cm pada kaca objek. Darah harus habis sebelum kaca penghapus mencapai ujung lain dari kaca objek. Apusan darah tidak bolah terlalu tipis atau terlalu tebal, ketebalan ini dapat diatur dengan mengubah sudut antara kedua kaca objek dan kecepatan menggeser. Makin besar sudut atau makin cepat menggeser, maka makin tipis apusan darah yang dihasilkan. 
e. Apusan darah dibiarkan mengering di udara. Identitas pasien ditulis pada bagian tebal apusan dengan pensil kaca.
2) Cara Mewarnai Sediaan Apus
• Pewarnaan Wright
a. Letakkan sediaan apus pada dua batang gelas.
b. Fiksasi sediaan apus dengan metanol absolut 2 – 3 menit. 
c. Genangi sediaan apus dengan zat warna Wright biarkan 3 – 5 menit.
d. Tambahkan larutan dapar tercampur rata dengan zat warna. Biarkan selama 5 – 10 menit.
e. Bilas dengan air ledeng, mula-mula dengan aliran lambat kemudian lebih kuat dengan tujuan menghilangkan semua kelebihan zat warna.
f. Letakkan sediaan hapus dalam rak dalam posisi tegak dan biarkan mengering. 
• Pewarnaan Giemsa
a. Letakkan sediaan apus pada dua batang gelas di atas bak tempat pewarnaan. 
b. Fiksasi sediaan apus dengan metanol absolut 2 – 3 menit. 
c. Genangi sediaan apus dengan zat warna Giemsa yang baru diencerkan. Larutan Giemsa yang dipakai adalah 5%, diencerkan dulu dengan larutan dapar. Biarkan selama 20 – 30 menit. 
d. Bilas dengan air ledeng, mula-mula dengan aliran lambat kemudian lebih kuat dengan tujuan menghilangkan semua kelebihan zat warna.
e. Letakkan sediaan hapus dalam rak dalam posisi tegak dan biarkan mengering.
• Pewarnaan May Grunwald – Giemsa (MGG)
a. Letakkan sediaan apus yang telah difiksasi diatas rak pewarnaan
b. Genangi sediaan apus dengan zat warna May Grunwald yang telah siap pakai, biarkan 2 menit
c. Tambahkan larutan buffer pH 6.4 sama banyak dengan larutan MGG yang telah diberikan sebelumnya.
d. Tiup agar larutan dapat tercampur rata dengan zat warna. Biarkan selama 2 menit.
e. Bilas dengan air (buang kelebihan zat warna).
f. Genangi dengan larutan Giemsa 5% (larutan buffer pH 6.4 10 ml + Giemsa 0,5 ml) biarkan selama 10-15 menit.
g. Bilas dengan air ledeng, mula-mula dengan aliran lambat kemudian lebih kuat dengan tujuan menghilangkan semua kelebihan zat warna.
h. Letakkan sedian dalam sikap vertikal dan biarkan mengering sendiri.
C. Pasca Analitik
1) Evaluasi Eritrosit 
a. Ukuran (size): Diameter eritrosit yang normal (normositik) adalah 6 – 8 µm atau kurang lebih sama dengan inti limfosit kecil.
b. Bentuk (shape): Bentuknya bikonkaf bundar dimana bagian tepi lebih merah daripada bagian sentralnya.
c. Warna (staining): Bagian sentral lebih pucat disebut akromia sentral yang luasnya antara 1/3 -1/2 kali diameter eritrosit.
d. Benda-benda inklusi (structure intracel)
e. Distribusi: merata
2) Evaluasi Lekosit
a. Eosinofil (1% - 3%)
b. Basofil (0-1%)
c. Neutrofil batang (2%-6%)
d. Neutrofil segmen atau sel PMN (50%-70%)
e. Limfosit (20%-40%) dan monosit (2%-8%).
3) Evaluasi Trombosit
Diameter trombosit adalah 1-3 µm, tidak berinti, mempunyai granula dan bentuknya reguler. Perkiraan jumlah trombosit dalam keadaan normal diperkirakan terdapat 1 trombosit per 15 – 20 eritrosit atau 5 – 15 per lapangan pandang imersie.
3. PEMERIKSAAN RETIKULOSIT
A. Pra Analitik
1) Persiapan pasien: tidak memerlukan persiapan khusus.
2) Prinsip: Darah dicampur dengan larutan, Brilliant Crecyl Blue atau larutan New Methylene Blue, lalu dibuat sediaan. Dan jumlah retikulositnya dihitung dibawah mikroskop. Jumlah retikulosit dihitung per 1000 eritrosit dan dinyatakan dalam %
3) Alat dan bahan
a. Alat
• Tabung reaksi kecil
• Kaca obyek dan kaca penggeser 
• Pipet Pasteur
• Penangas air 
• Mikroskop.
b. Bahan
• Sampel darah
• Brilliant Cresyl Blue
• New Methylene Blue (Colour Index 52030)
• Larutan sitrat salin
B. Analitik
• SEDIAAN KERING
a. Kedalam tabung reaksi kecil teteskan 3 tetes larutan Brilliant Cresyl Blue atau New Methylene Blue.
b. Tambahkan 3 tetes darah, campurkan baik-baik dan biarkan pada suhu ruangan selama 15 menit agar pewarnaan sempurna.  Cara yang lain: Setelah ditambahkan 3 tetes darah, campurkan baik-baik, tabung ditutup dengan parafilm dan diinkubasi pada 370c selama 30-60 menit.
c. Setelah inkubasi, tabung dihomogenkan lagi dan ambil 1 tetes untuk membuat sediaan apus. Keringkan di udara dan diperiksa di bawah mikroskop.
d. Periksalah dengan perbesaran obyektif 100 kali. 
e. Dicari daerah yang baik yaitu eritrosit tidak tumpang tindih. Retikulosit tampak sebagai sel yang lebih besar dari eritrosit. Dan mengandung filamen atau granula. Dengan BCB, eritrosit berwarna biru keunguan dengan filamen atau granula berwarna ungu.  Bila menggunakan NMB, retikulosit berwarna biru dengan filamen atau granula berwarna biru tua.
f. Hitunglah jumlah retikulosit per 1000 eritrosit dengan lensa emersi 
g. Jumlah retikulosit dapat dinyatakan persen per mil terhadap jumlah eritrosit total atau dilaporkan dalam jumlah mutlak.
• SEDIAAN BASAH
a. Taruh 1 tetes larutan BCB ditengah-tengah kaca obyek. 
b. Tambahkan 2 tetes darah dilarutan BCB, homogenkan darah dengan larutan BCB dengan menggunakan sudut kaca obyek.
c. Tutup dengan kaca penutup 
d. Periksa dengan minyak emersi.
Jika didapatkan jumlah retikulosit yang tinggi atau disertai dengan nilai hematokrit rendah maka dilakukan koreksi terhadap nilai retikulosit.
C. Pasca Analitik 
Nilai rujukan= 0,5 – 1,5%
Hitung retikulosit meningkat pada: perdarahan akut, hemolisis,
RP I  <2% = kegagalan sum-sum tulang membentuk eritrosit.
RP I 2–3% = respons baik terhadap anemia hemolitik
RP I  >3% = Hiperproliferasi
4. TES COOMB’S
A. Pra Analitik
1) Persiapan  pasien: Catat daftar obat yang sedang dikonsumsi pasien. Obat yang dapat mempengaruhi tes ini adalah penisilin, sefalosporin, antihipertensi dan  lain-lain.
2) Prinsip: Penambahan serum Coomb‟s (serum hewan yang mengandung antibodi spesifik terhadap globulin manusia) pada eritrosit yang tersensitisasi atau eritrosit yang terbungkus dengan imunoglobulin atau komplemen akan menimbulkan suatu aglutinasi .
3) Persiapan sampel: hindari sampel hemolisis, sampel darah dengan antikoagulan natrium sitrat 3,8%. Tes sebaiknya dilakukan selambatnya 2 jam.
4) Alat dan bahan
a. Alat
• Tabung reaksi 
• Pipet tetes
• Sentrifuge
• Inkubator
• Kaca obyek dan kaca penggeser
b. Bahan
• Darah sitrat (1:9) 
• Larutan NaCl fisiologis (0,9%)
• Reagen Coomb‟s
A. Analitik
1) Sebanyak 0,5 ml darah yang diperiksa dimasukkan ke dalam tabung reaksi.
2) Lakukan pencucian eritrosit 4 kali berturut-turut dengan setiap kali dilakukan sentrifus kemudia plasma dibuang.
3) Buatlah suspensi eritrosit yang tertinggal dalam tabung setelah sentrifus terakhir dengan menambah sekian banyak NaCl fisiologis sampai suspensi eritrosit mempunyai nilai hematokrit 2%.\
4) Ke dalam tabung 75 x 10 mm, masukkan 1 tetes suspensi tadi kemudian tambahkan dengan 2 tetes reagen Coomb‟s.
5) Campur kemudian inkubasikan pada suhu 370C selama 30-50 menit.
6) Kocok dengan hati-hati tabung tersebut lihat adanya aglutinasi, konfirmasikan dengan menggunakan mikroskop.
7) Jika hasilnya negatif lakukan sentrifus kembali dengan 1000 rpm selama 1 menit.
8) Periksa kembali adanya aglutinasi seperti langkah 6.
9) Bandingkan hasil tes dengan kontrol positif dan kontrol negatif.
C. Pasca Analitik
Negatif: Tidak terjadi aglutinasi membuktikan adanya antibodi yang melapisi eritrosit.
Positif: Terjadi aglutinasi membuktikan adanya antibodi yang melapisi eritrosit.
5. TES FE SERUM DAN TIBC (Total Iron Binding Capacity)
A. Pra Analitik
1) Persiapan pasien: pasien berhenti meminum obat oral Fe 12 jam sebelumnya.
2) Persiapan sampel: serum atau plasma heparin
3) Prinsip:
• Fe Serum: Ikatan  antara ferri (Fe3+) dan transferrin dilepaskan oleh guanidine dalam suasana pH ,8. Asam askorbat akan 4mere4d4uksi io4n ferri (Fe3+) menjadi ferro (Fe+) kemudian akan bereakdi dengan ferrozine membentuk komplek berwarna.
• TIBC: TIBC dievaluasi setelah transferrin sampai junuh oleh larutan besi dan kelebihan besi akan diabsorpsi oleh magnesium hydroxide carbonate. Setelah dicentrifuge, konsentrasi besi dalam supernatant diukur.
4) Alat dan bahan
a. Alat
• Tabung plastik
• Glassware
b. Bahan
• Serum atau plasma heparin
• Iron free water
• Reagen 1, reagen 2  dan reagen 3 Fe serum
• Reagen 1 dan reagen 2 TIBC
• Standar
B. Analitik
• Fe Serum
a. Membuat larutan kerja dengan cara melarutkan 1 sendok reagen 2 dalam 0 ml reagen 1. Tunggu hingga tercampur dengan baik. Stabilkan selama  minggu pad4a suhu 2-8 0C dan 3 hari pada suhu 20-25 0C.
b. Masukan blanko aquades 10 ul pada tabung pertama, pada tabung kedua dimasukan standar 150 ul dan pada tabung ketiga diisi sampel sebanyak 150 ul. Tambahkan masing-masing tabung 500 ul reagen kerja. Tunggu selama 50 detik kemudian baca OD pada panjang gelombang 560 nm (A1 dan A2).
c. Masukan reagen 3 sebanyak 25 ul pada tabung pertama, kedua dan ketiga dimana tabung kedua dan ketiga sebagai A3 dan A4. Tunggu selama 325 detik kemudian baca OD pada panjang gelombang 560 nm (A3 dan A4).
Penghitungan: A4-A24/A3-A1 x konsentrasi standar (n)
• TIBC
a. Dimasukan 1 ml reagen R1 dan sampel 0,5 ml pada tabung 1. Inkubasi selama 5 menit.
b. Ditambahkan 1 sendok takar reagen R2 pada.
c. Inkubasi selama 20 menit kemudian dicentrifuge 3000 rpm selama 10 menit.
d. Diambil supernatant
e. Diperiksa supernatan seperti pada S1 dengan supernatant : regan=1:3.
D. Pasca Analitik
Fe Serum: 0,5-1,68 mg/dl
    50-168 ug/dl
    8,95-430 umol/l
TIBC:
• Laki-laki dewasa: 2,6-3,9 mg/l
446,5-69,8 umol/l
260-390 ug/l
• Wanita dewasa: 2,1-3,44 mg/l
        37,6-60,9 umol/l
        210-340 ug/l
6. TES ELEKTROFORESIS HEMOGLOBIN
A. Pra Analitik
1) Persiapan  pasien: Tidak ada perkhusus yang diperlukan.
2) Prinsip: Diukur Hb yang tidak terdenaturasi dengan penambahan sodium hidroksida kemudian 4ditambahkan ammonium sulfat lalu diukur.
3) Persiapan sampel: disimpan satu minggu pada 40C.
4) Alat dan bahan
a. Alat
• Spektrofotometer
• Stopwatch
• Pipet 1,5
• Kertas saring whatman
• Tabung 12x10 mm
• Vortex mixer
• Funnels
b. Bahan
• Hemolisat
• Cyanide solution
• NaOH 1,2 N
• Ammonium sulfat jenuh
B. Analitik
1) Masukkan 3,8 ml larutan sianida ditambah 2 ml hemolisat untuk membuat HiCN.
2) Dipindahkan ke dalam 2 tabung dimana tabung pertama sebanyak 0,4 ml HiCN dengan 6,75 ml aquadest kemudian dibaca pada panjang gelombang 540 nm sebagai A Hb total.
3) Pada tabung kedua dimasukan HiCN se4banyak 2,8 ml. biarkan 10 menit pada suhu ruang.
4) Dimasukkan 2 ml NaOH kemudian dicampur dengan vortex selama -3 detik kemudian inkubasi selama 2 menit.
5) Dimasukkan  ml (NH2)2SO4 dicampur dengan vortex selama 10 detik kemudian biarkan selama 5 menit.
6) Disaring dengan kertas whatman kemudian baca pada panjang gelombang 540 nm sebagai A Hb resisten alkali.
Perhitungan presentasi Hb F
%Hb F= A540 Hb resisten alkali x 100
      A540 Hb total x 10,01
C. Pasca Analitik
Nilai normal: 0,2-1,0%
7. TES EVALUASI SUMSUM TULANG
A. Pra Analitik
1) Persiapan  pasien: Diberitahukan kepada pasien langkah-langkah  yang akan dilakukan, melakukan pemeriksaan darah lengkap, apusan darah tepi, faktor pembekuan darah seperti prothrombin time, INR, APTT untuk memastikan tidak ada resiko perdarahan data prosedur dilakukan.
2) Prinsip: P4ereaksi asam-basa yang saling berikatan antara  cat dengan sel darah, sesuai dengan sifat pH dari setiap sel yang terdapat pada sel-sel darah tersebut. Giemsa pada dasarnya merupakan gabungan dari dua macam cat yaitu methylene blue dan eosin dimana methylene blue bersifat basa akan berikatan dengan bagian sel yang bersifat asam dan memberikan warna biru sedangkan eosin yag bersifat asam akan mewarnai bagian sel yang bersifat basa.
3) Persiapan sampel: disimpan satu minggu pada 40C.
4) Alat dan bahan
a. Alat
• Objek glass
• Pipet tetes
• Cawan petri
• Rak tabung
• Mikroskop
b. Bahan
• Sampel sumsum tulang
• Tabung darah
• Metanol
• Giemsa
B. Analitik
1) Pembuatan preparat spread (sebar)
a. Siapkan alat dan bahan yang akan digunakan
b. Letakkan objek glass di cawan petri dengan cara dimiringkan
c. Teteskan 3-4 tetes sampel sumsum tulang di atas objek glass tersebut
d. Diambil bagian fragmen menggunakan ujung objek glass yang baru
e. Buat apusan di atas objek glass yang lain
f. Keringkan kemudian fiksasi dengan methanol selama 5-10 menit
2) Pembuatan preparat squash (tekan)
a. Siapkan alat dan bahan yang akan digunakan
b. Letakkan objek glass di cawan petri dengan cara dimiringkan
c. Teteskan 3-4 tetes sampel summsum tulang di atas objek glass tersebut
d. Letakkan di atas objek glass baru
e. Ratakan dan tekan kemudian geser secara datar sampai ujung objek glass dengan cepat
f. Keringkan kemudian fiksasi dengan methanol selama 5-10 menit
3) Pewarnaan giemsa
a. Genangi sediaan dengan larutan kerja gie4msa selama 20-30 menit
b. Sisa cat dibuang kemudian cuci dengan air mengalir
c. Keringkan dan periksa di bawah mikroskop
C. Pasca Analitik
1) Normoselluler : volume lemak 20% dari sel hemapoietik
2) Hyposelluler : sel hemapoietik diganti oleh sel lemak
3) Hyperselluler : hampir semua lemak diaganti oleh sel hemapoietik
8. TES KADAR ASAM FOLAT/VITAMIN B12 PLASMA
A. Pra Analitik
1). Persiapan pasien: Puasa (Tidak diperbolehkan makan dan minum, kecuali air putih) selama 12 jam sebelum pengambilan darah. Beberapa obat tertentu mungkin dihindari atau dihentikan konsumsinya, kecuali dokter tetap menganjurkan mengonsumsi obat atau kondisis kesehatan tidak memungkinkan (informasikan hal ini kepada petugas laboratorium).
2). Persiapan Sampel: Serum, Plasma Heparin.
3). Prinsip: Menggunakan derivate dari luminol dengan peroksida dan H2O2 (atau aystem enzimatik lainnya yang menghasilkan H2O2 seperti oksidase glukosa atau uricase) ditambah penambah (turunan dari fenol, seperti (piodofenol), yang meningkatkan emisi cahaya sampai 2.800 kali.
4). Alat dan Bahan:
a. Alat
• Mikropipet
• Sentrifuge
• Mikroplate Reader Set
a. Bahan
• Serum/Plasma
• Tabung EDTA
• Larutan Biotin Antibodi
5). Metode: Chemiluminescence
B. Analitik
1) Darah vena yang telah diperoleh kemdian dimasukkan kedalam tabung yang menggunakan EDTA
2) Untuk mendapatkan plasma, darah di sentrifuge selama 15 menit dengan kecepatan 1000xg pada suhu 2-80 dalamwaktu 30 menit
3) Dipipet plasma pada control sebanyak 50 µL, dipipet ke dalam microplate. Segera tambahkan well microplate masing-masing dengan 50 µL larutan Biotin Antibodi.
4) Inkubasi selama 45 menit pada suhu 370C kemudian homogenkan hingga terlihat seragam
5) Setiap well di cuci 3 kali dalam wadah buffer sebanyak 350 µL, lalu buang cairan dalam well masing-masing weel ditentukan segara dengan menggunakan microplate reader set pada panjang gelombang 450nm.
C. Pasca Analitik
Nilai rujukan: 300-400 mcg/hari